Di dalam gen, urutan nukleotida sepanjang untaian DNA menentukan rantaian serta jenis protein, yang akan dihasilkan oleh organisma atau pengekpresan gen pada satu atau beberapa titik pada hayatnya menggunakan maklumat urutan ini. aitan antara urutan nukleotida dan urutan asid amino protein ditentukan oleh hukum selular (cellular) mudah terjemahan, dikenali keseluruhannya sebagai kod genetik. Membaca sepanjang urutan "pengkod protein", setiap urutan tiga nukleotida berikutnya (dikenali sebagai kodon) menentukan atau "mengkodkan" satu asid amino.

Dalam kebanyakan spesis organisma, hanya sebahagian kecil dari seluruh urutan genom kelihatan mengandungi kod protein. Fungsi yang selebihnya menjadi spekulasi. Ia diketahui bahawa urutan nukleotida tertentu mempunyai kecenderungan untuk protein pengikat DNA, yang memainkan pelbagai peranan luas, khususnya melalui penyalinan terkawal dan transkripsi. Urutan ini selalunya dipanggil urutan pengawal(regulatory sequence), dan penyelidik menjangkakan bahawa setakat ini mereka hanya mengenal pasti hanya sebahagian kecil daripada sepenuhnya. "Sampah DNA" mewakili urutan yang masih belum kelihatan mengandungi gen atau mempunyai fungsi.

Urutan juga menentukan bahagian DNA yang cenderung kepada belahan oleh enzim pendam, maklumat terpenting dalam bidang kejuruteraan genetik. Kedudukan tapak belahan (cleavage sites) sepanjang genom seseorang menentukan cap jari DNA seseorang.